图片源于：https://www.nature.com/articles/s41598-024-60604-7
在中国东南部的泉州地区，四个无关联家庭因血液分析及Hb毛细管电泳筛查结果异常而参与了本研究。
所有的先证者都有类似的异常Hb Lepore带，位于Hb区域6，表现为MCV（平均红细胞体积）和MCH（平均红细胞血红蛋白含量）水平降低，并被怀疑为地中海贫血携带者。
参与的四个家庭的所有成员均否认近期接受过输血。
在签署书面知情同意后，研究团队为参与者收集了外周血样本，以进行进一步的分子诊断。
本研究得到了泉州市妇幼保健院伦理委员会的批准（2021No.61）。
在接受常规血液筛查方面，利用自动细胞计数器（Sysmex XS-1000i；日本Sysmex公司，神户）检测了MCV和MCH水平。
此外，采用Hb毛细管电泳（Sebia, Evry Cedex, France）检测Hb A，Hb A2和Hb F的水平及其他异常血红蛋白带。
阳性血液筛查结果包括以下任一标准：MCV < 82 fL，MCH < 27 pg，Hb A2 > 3.4%，Hb A2 < 2.6%，Hb F > 2.0%及异常Hb带。
所有四个家庭的成员随后进行了地中海贫血基因检测。
参与家庭成员的基因组DNA通过自动核酸提取器（Ruibao Biological Co., Ltd）提取，并根据制造商的协议通过PCR-RDB检测了23种在中国人群中常见的α-地中海贫血和β-地中海贫血变异。
为了检测血红蛋白基因的变异，采用基于PacBio Sequel II平台的第三代测序。
提取的基因组DNA随后送至Berry Genomics实验室进行第三代测序。
简而言之，通过使用Qubit dsDNA BR测定试剂盒（ThermoFisher Scientific）定量纯化后的DNA样本，然后使用优化的引物生成特定的扩增子，以涵盖已知的结构变异区域及HBA1/2和HBB基因中的单核苷酸变异，基于HbVar、Ithanet、LOVD和LOVD-China等数据库。
经过纯化和末端修复后，双条形码接头被连接到5’和3’两端，并使用Sequel Binding和Internal Ctrl Kit 3.0（PacBio）制备SMRT bell文库。
最后，在PacBio Sequel II系统上进行第三代测序，加载DNA聚合酶复合物到SMRT细胞上。
在对亚读长进行比对后，得到的共识环状序列被映射到GRCh38参考基因组，并调用变异（FreeBayes软件，版本1.2.0）。
使用WhatsHap（版本0.18）软件分析长读长中两个变异之间的顺反向配置，并使用整合基因组查看器可视化变异和野生型分子的比对。
最后，特定的Gap-PCR扩增和Sanger测序被应用于确认第三代测序检测到的稀有或新颖的血红蛋白基因变异。
Gap-PCR用于识别缺失的断点。
我们根据已知DNA序列设计了特定引物来确定断点或血红蛋白基因序列变异。
所有的引物均在Sangon Biotech（上海）合成。
Gap-PCR反应体系包括：5 ×缓冲液5μL，25 mmol dNTPs 0.2μL，25 mmol MgCl 2 1.5μL，Taq酶2.5U，10 μmol引物各1μL，模板2μL，去离子水加至25μL。
扩增条件为95℃预变性10分钟，随后进行35个循环，94℃变性1分钟，62℃退火30秒，72℃延伸1分钟，最后72℃延伸5分钟。
电泳分析完成后，纯化的电泳产物送去进行Sanger测序。
此外，Sanger测序还用于血红蛋白基因变异的检测。
测序数据与GenBank NG_000007.3作为参考序列进行分析。
此研究得到了泉州市妇幼保健院伦理委员会的批准（2021No.61）。
我们得到了研究参与者及其父母的知情同意，他们同意对本研究的报告进行出版。
所有与人类参与者相关的程序均遵循了机构和/或国家研究委员会的伦理标准，以及1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修订或可比伦理标准。
